柱層析的基本操作
柱層析的基本操作
柱層析的基本操作包括以下一些步驟： ⑴ 裝柱
柱子裝的質量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質的關鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
shou先選好柱子，根據層析的基質和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。
將層析用的基質（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當的溶劑或緩沖液中溶脹，并用適當濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內部的氣泡。
關閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約高。
打開出水口，控制適當流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
**后使柱中基質表面平坦并在表面上留有2~高的緩沖液，同時關閉出水口。（采用機械化裝柱法在此省略。） ⑵ 平衡
柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強度）平衡柱子。用
恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩定及基質充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進行轉型處理。這方面的內容在離子交換層析中加以介紹。 ⑶ 加樣
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當然，**大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。
應注意的是，加樣時應緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質，以保持基質表面平坦。詳細操作見層析實驗。 ⑷ 洗脫
當我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結束為止。如果被分離物質對固定相的親合力差異不大，其區帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數較大。否則應采用下面的方法。
分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。**常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強度梯度。可形成梯度的形式有三種，如圖3－4 所示（以鹽濃度梯度為例）：
我們可以通過下式計算得到流經層析柱的洗脫液中鹽濃度的計算公式：
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中： C ：流經層析柱的洗脫液的鹽濃度 CB ：
梯度混合器中B 瓶的鹽濃度（不攪拌） CA ：
梯度混合器中A 瓶的鹽濃度（攪拌） B1 ：B 瓶的橫切面積 A1 ：A 瓶的橫切面積
V2 ：流經層析柱的洗脫液體積 V1 ：梯度洗脫液總體積
洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當對所分離的混合物的性質了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質相近的組分分離更為有利。同時還應注意洗脫時的速率。前面我們已經談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質的擴散，同樣達不到理想的分離效果。只有多次試驗才會得到合適的流速。總之，我們必須經過反復的試驗與調整（可以用正交試驗或優選法），才能得到**佳的洗脫條件。還應強調的一點是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。 ⑸ 收集、鑒定及保存
在生化實驗中，基本上我們都是采用
部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質性質很相近，可低**0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進行鑒定。對于是單條帶的，認為已達電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質采用相應的鑒定方法，在這里不再敘述。**后，為了保持所得產品的穩定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存備用。
