根據對生物產物分離工程的學習及所做的相關實驗，我對這方面的知識有了粗淺的認識。根據所學知識我發現生物產物分離的方法多種多樣，不同產物其分離方法不同，同種產物又有多種分離方法。就所做的實驗而言，我對層析法分離蛋白比較感興趣。以下是我對這種方法的了解：
層析法是分離蛋白質通用的方法。其原理都是通過蛋白質在流動相和固定相之間的性質不同而達到分離的效果。層析法可分為紙層析法，凝膠過濾層析法，離子交換層析法等。凝膠過濾層析法**為常用，在分離蛋白質時只需要把蛋白質混合液加到凝膠珠的上部，并加少許洗脫液來產生一定的液壓是蛋白質能向下運動，在凝膠柱底部用試管接流下來的蛋白質液體，進行比色。此種方法很簡單，不需要貴重儀器，但分離的蛋白質不是很好，這些液體仍然是很多蛋白質的混合液，通過比色來確定目的蛋白含量的**高值。這種方法只能對蛋白質進行一些粗篩。
近期做了一個實驗應用到了凝膠層析即凝膠柱層析分離蛋白質，這個實驗主要是運用凝膠層析 分離藍色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。這個實驗應注意：1、裝柱時要注意凝膠的流速，不宜過快，同時要保證凝膠能充分的沉淀且分布的比較均勻; 2、凝膠溶脹所用的溶液應與洗脫用的溶液相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積會發生變化而影響分離效果; 3、樣品的濃度和加樣量的多少。是影響分離效果的重要因素。樣品濃度應適當大，但大分子物質的濃度大時，溶液的黏度也隨之變大，會影響分離效果，要兼顧濃度與黏度兩方面。加樣量和加樣體積越少分離效果越好，加樣量一般為柱床體積的1%-2%，制備用量一般為柱床體積的20%-30%；4、凝膠用完后可再加入防腐劑低溫保存；5、疊氮鈉屬于有毒性物質，在使用過程中需注意安全。
凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。具有以下特點：1．凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。 2．分離效果較好，重復性高。**突出的是樣品回收率高，接近100％。3．分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。4．應用廣泛。適用于各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102～105d；Sepharose類為105～108d。5．分辨率不高，分離操作較慢。
由于凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對于分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。
凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學穩定性，是目前生化產品制備中**常用的凝膠。 親脂性葡聚糖凝膠凝膠既親脂又親水，可在多種有機溶劑中膨脹。這種凝膠在pH＞2的不含氧化劑的溶液中穩定。用低級醇為溶劑時，對芳香族、雜環族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時則可去除對上述化合物的吸附作用，而對含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用 。在G類凝膠上引入一些酸性或堿性基團后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑 。聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺 和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺通過自由基引發聚會形成聚丙烯酰胺凝膠。 只要控制單體用量和交聯劑的比例，就能得到不同型號的凝膠 。
凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細和超細四類。顆粒越細，分離效果越好，因為它容易達到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區帶擴散，使洗脫峰變平變寬。
新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗其均勻性－可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。通過實驗結果可知由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導致粘度增大，而使層析分辨率下降一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100 mL床體積加樣品20～30 mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。
樣品上柱是凝膠層析中**關鍵的一步。理想的樣品色帶應是狹窄且平直的巨型色譜帶。為了做到這一點，應盡量減少加樣時樣品的稀釋以及樣品的非平流流經凝膠層析床體。反之將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴重影響分離效果洗脫劑的流速對分離效果也有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線。#p#分頁標題#e#
凝膠過濾層析遇見的問題及分析如下：
1．
流速慢：有氣泡、出水管阻塞、沒打開夾子、柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣。
2．
柱內產生氣泡：上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流、接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊
3． 條帶扭曲：膠面不平、樣品或洗脫液中有顆粒、裝拄不均勻 4．
分辯率不高：裝拄不均勻、樣品量過大、流速太快、拄不垂直或拄不合適、長菌、拄下口軟管太長、膠不適當。
凝膠層析主要根據被測樣品分子量的差異，在固定相上受到阻滯程度不同而達到分離的目的。分子量大的物質隨流動相移動速度較快，先流出層析床，并在記錄儀上出現層析峰。反之，分子量小的物質移動速度較慢，后出現層析峰。實驗中**個波峰是藍色葡聚糖2000kb,后一個則是牛血清蛋白70kb.。 鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡單，保持樣品的生物活性等優點，這種方法已廣泛應用于大分子物質的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測定。其運用如下：大連灣牡蠣蛋白的分離提取及分子量測定、地龍生物活性部位經膜分級分離后降壓作用的比較研究、復雜蛋白質樣品中目標組分柱層析分離純化策略研究、桔梗多糖的分離純化與含量測定、聚丙烯酰胺凝膠柱分離制備低聚果糖單組分、庫拉索蘆薈多糖的提取及分離純化與活性研究、凝膠柱層析_考馬斯亮藍染色法測定牛奶中的真蛋白質、人工培養冬蟲夏草胞外多糖的分離純化研究等。
