3．裝柱 層析柱的填裝是先關閉出口，用溶劑灌注**1/3體積，并使支持板下的“死體積”不存有氣泡，再慢慢地向溶劑中加漿狀物，要小心地沿著玻棒傾注以防止氣泡存留在柱內。讓懸浮液沉淀，并放出過多的溶劑，為了避免分層，**好一次裝完，如需分幾次填裝，則在二次填裝前應先在已經沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復這個過程，直**裝到需要的高度。用溶劑徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點。**后覆蓋一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面（圖3-1）。   4．加樣 上柱前，先將樣品溶解在溶劑里或對洗脫液透析，樣品溶液的濃度應該盡可能高些，以減少樣品溶液體積，使區帶狹窄。將樣品仔細加到層析床的表面，打開旋塞**液面與床面齊，然后連接溶劑池，保持一定高度的液面。 

  5．洗脫 下一步是用適當的洗脫液把各組分依次從柱上洗脫下來。   在取代擴展法中，溶劑與層析材料的相互作用比柱上的物質與層析材料的相互作用要強，于是與柱結合的分子被取代。每一個柱能結合多少物質都有一個限度（即總柱容量）。在取代擴展的情況下，當樣品上柱量差不多達到總柱容量的50％時，一般尚能完全分離。但是為了得到更好的分辨力，洗脫法更為可取。 

  洗脫法是**常用的方法。使用洗脫法，上柱量不超過總柱容量的10％，溶劑與柱的相互作用比溶質與柱的相互作用弱，溶劑越過結合的分子，逐漸地將它們從柱上沖洗下來。在沖洗過程中各組分因為吸附力不同而逐漸分離。在一個組分被洗脫后可以更換洗脫液，這就是所謂的分步洗脫。另外，還有一個可行的方法是逐漸改變溶劑的性質，形成一個離子強度、pH或極性的遞增梯度從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱梯度洗脫，它的優點之一是能夠減少拖尾現象。 

  6．部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列試管中或使用部分收集器。這種裝置能使每一管按預定的時間或滴數收集流出液，然后自動移位，下一管再繼續收集。洗脫完畢后可選用各種適宜的方法將已收集的許多部分流出液進行定量分析，并畫出洗脫物的量對流出液體積的洗脫曲線。每一部分的蛋白質或核酸的含量可以讓流出液通過一個流動小室測定其280 nm或260 nm的光吸收來進行連續監測。