在過去的三十年中，分離生物大分子的各種技術和方法得到了不斷的發展。隨著各種介質的完善和商品化，使以填料為核心的柱層析技術在天然產物等粗提后的純化中起到了重要作用。 

1 疏水作用柱層析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC) 

HIC是以蛋白質的疏水性為分離基礎的。具體說就是一種通過表面疏水性差異來分離蛋白質的柱層析方法。 

疏水鍵的形成對于非極性基雙方無特異性要求，不同蛋白質表面及內部疏水區的多少、大小、強弱、分布及空間位阻效應各不相同，這也是HIC分離蛋白質的根本所在。在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強弱順序為Trp、Ile、Phe、Pro、ValLeu、Met、Ala。當介質和上樣蛋白濃度不變時，影響HIC的因素較多，主要有①鹽類，其作用是使暴露出界面的非極性基，使容易形成疏水作用，其次是增加水相極性，提高界面的表面張力，鹽濃度越高，促疏水作用越強。一般常采用的促疏鹽為(NH4)2SO4。②混溶有機溶劑，作用是使界面張力減弱，減少疏水作用。③溫度，當體系溫度由4℃升高到25℃時，疏水作用力增加20%～30%，這主要是由于動能增大，提高表面張力，一般當溫度降低，可增大鹽濃度，使疏水作用不降低。④pH，當pH≈pI時可消除表面電荷的相斥作用，同時表面活性劑與變性劑也對其有影響。 

HIC適用范圍廣，原則上可用于所有蛋白質純化，處理量大，特別是從大體積樣品中提取低含量的目標蛋白顯優勢，可取代傳統的鹽析沉淀技術。HIC對DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率較高，尤其是對細胞DNA一步去除率可達90%以上。原則上HIC可放在純化工藝的任何位置，但大部分放在前面。由于它也屬吸附型柱層析，尤其是對蛋白質空間內部的疏水作用可使此步損失較大，對蛋白質的結構也有微細作用。 2凝膠過濾柱層析(Gel Filtration Chromatography，GFC) 

GFC是以分子大小和形狀為分離基礎的。具體說就是利用不同大小分子通過凝膠滯留時間的差別來分離混合物的柱層析方法。另外一種說法是分離是以分子體積的大小為基礎的，分子體積即分子溶劑化后的體積，受分子形狀和相對分子質量兩方面因素的影響。有時加入變性劑(尿素、鹽酸胍等)以破壞蛋白質的三、四級結構，可以使分離主要受控于相對分子質量的大小。 

GFC特別適用于分離相對分子質量大于2000的高分子化合物和相對分子質量差異大的混合物及低聚物。GFC的分離不依賴于流動相和固定相的相互作用，所以不必使用梯度洗脫。但是由于電荷屏蔽的因素，為了降低填料與生物分子之間的相互作用，往往會適當提高鹽濃度，**少高于0.05 mol/LNaCl。由于試樣在柱中的保留時間不會超出柱中溶劑的總體積(Vt)，所以不會出現在其他液相色譜中經常出現的由于色譜峰的彌散而引起的檢測極限GFC的容量通常由流動相效應來控制。由于GFC的分離靠大小組分流程途徑長短之差達到分離，柱要有足夠的長度(75～100 cm)，但由于微小的粒子在GFC也有擴散的效應，柱子又不可過長，上樣量不可過多(<20%Vt)。因為GFC洗脫時間可粗略估計，所以再隔一定時間連續進樣，提高柱的使用效率，縮短純化周期。除了以上特點外，GFC還有回收率較高，洗脫條件溫和，不易發生副反應，使用壽命較長，同時可用作換鹽等特點。但由于處理量小，分離蛋白能力相對較弱，柱層析時間較長，在設計純化工藝時一般不宜放在前面。 

3離子交換柱層析(Ion Exchange Chromatography，IEC) 

IEC是以蛋白質分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎的。具體說就是利用蛋白質帶電性的差異，在離子吸附劑上靜電吸附能力不同，用不同的pH/離子強度洗脫液洗脫，從而使蛋白質分離的柱層析方法。離子交換又分為陰離子交換和陽離子交換。離子交換劑又有強弱之分，強的離子交換劑在整個pH范圍內都是離子化的，而弱的離子交換劑通常僅在pH6～9之間是離子化狀態，因而后者對所適用的pH范圍又有了進一步的限制。 

在洗脫方式上，陽離子交換主要是改變pH，它主要應用于等電點大于5的蛋白質；而陰離子交換主要是改變鹽濃度，適用于大部分蛋白質。20種氨基酸中，大部分帶正電或負電，這是IEC應用范圍廣的原因。IEC處理量大，附載系數高，一步縮小樣品體積很多。IEC去除雜質能力強，如對熱原質，核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及電荷性有差別的蛋白均可去除。它還有一個特點，利用蛋白質在不同pH和鹽濃度下帶電性的不同，通過不同條件下應用同種類型或不同類型介質(如DEAE、CM)，分兩步IEC使目標蛋白質達到提純目的，這是除親和柱層析外，別的柱層析達不到的分離能力。IEC原則上講可放在純化工藝的任何一步，它屬吸附型層析，單步損失也較大。擴大純化工藝時，尤其要按放大直徑考慮，而不能只單獨放大柱高。一般來說柱高不能大于柱直徑的4倍，否則純化結果和小試會相差較多。 

IEC的洗脫一般分3種：①同步洗脫(Isocratic)，即鹽濃度不變，這一般都應用于樣品的性質已熟知，洗脫重復性好，而且大部分是用于分析類分離。②分步洗脫(Stepwise)，即用幾次同步洗脫方式，分別換幾次鹽濃度分步洗脫。這種方式大部分用于在其中一種鹽濃度洗脫峰中收獲一種目標蛋白，但這種方式也存在一些問題，如一個洗脫峰可含有二種蛋白或一個蛋白分散于兩個峰中，所以一般分步洗脫方式**好用于已知性質的蛋白質分離。③梯度洗脫(Gradient)，按一定的濃度梯度連續改變鹽濃度進行洗脫的方式。如增加速度不變稱為線性梯度洗脫(Line Gradient)，這種方式在三種洗脫中響應能力**強，蛋白峰形一般不會拖尾，很少有一種蛋白出現在幾個峰中。所以對電荷性質相近組分的分離和蛋白質較大、表面電荷分布范圍廣的組分的分離**好采用這種方式。 4親和柱層析(Affinity Chromatography，AC) #p#分頁標題#e#

AC是以蛋白質特殊結構為分離基礎的。具體說就是利用蛋白質和介質特殊的生物親和性或專一性和其他蛋白質分離的柱層析方法。如酶2底物或抑制物，抗原2抗體。 

AC的三個基本條件是：①偶聯凝膠，起支架作用。②配體，是AC的特征。在支持物和分離物間起聯接作用，這種和分離物特異的親和吸附具有專一性，并且是可逆的。③間臂，由于生物大分子空間位阻作用，需加一間臂，度很重要，太短不起作用，太長增加非特異性吸附，降低親和作用效率。 

     AC具有分離純化目標單一，回收率很高的特點。從理論上來講，AC得到的是相當純的物質，這種分離能力是其他任何柱層析都難以相比的，但由于AC柱制作工藝復雜，同時在色譜洗脫過程中配體不可避免的脫落，不但柱子的使用壽命有限，而且必須經特別處理才可注射或服用，因此成本比較昂貴，一般不放在純化工藝的前面。 

5 金屬螯合層析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)     IMAC是根據蛋白質中組氨酸等氨基酸殘基和介質中特殊金屬離子進行金屬螯合作用，形成絡合物以分離蛋白質的柱層析方法。蛋白質表面暴露出一定的氨基酸殘基(His、Cys、Try)是蛋白質吸附所需要的。蛋白質側鏈空間排列方式起重要作用，如電荷、分子體積、氨基酸組成等分子性質相似，但二級和三級結構不同的蛋白質分子可以分離。層析中單純的離子吸附和其他一些復雜因素可以減少或通過高離子強度的緩沖液進行改善，螯合作用受pH的影響，降低pH可解析已吸附的物質，但也有一些例外。在IMAC中可應用幾種洗脫方式，如pH梯度洗脫、競爭配體洗脫、有機溶劑洗脫、螯合劑洗脫。IMAC純化蛋白質時，金屬與蛋白質表面暴露的氨基酸殘基作用。IMAC在分離相應的蛋白質時，分離率和回收率也較高，它一般放在純化工藝的中后期。 

某些蛋白質、氨基酸和一些金屬離子的特異親和力舉例如下：Cu-同含氮化合物、單核苷酸、人乳鐵蛋白；Ni-同含酪氨酸、色氨酸的蛋白質或多肽、核酸；Zn-同含組氨酸、半胱氨酸的蛋白質或多肽。 

通過對柱層析及純化蛋白等理論的深入學習，才可將理論知識與實踐中積累的經驗相結合，從而，提高在天然產物的提取分離等方面的能力，為將來走上工作崗位奠定良好的基礎。